พันธุวิศวกรรม (Genetic Engineering) คือกระบวนการที่นำความรู้ต่างๆ ที่ได้จากการศึกษา ชีววิทยาระดับโมเลกุล หรืออณูชีววิทยา (Molecular Biology) ร่วมกับเทคโนโลยีดีเอ็นเอ มาประยุกต์ใช้ ในการปรับเปลี่ยน ดัดแปลงสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต เพื่อให้ได้สิ่งมีชีวิตใหม่ที่มีคุณสมบัติที่ต้องการ และเรียกสิ่งมีชีวิตใหม่ที่เกิดจากกระบวนการทางพันธุวิศวกรรมนี้ว่า สิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (Genetically Modified Organisms: GMOs) ขั้นตอนทางพันธุวิศวกรรมเพื่อให้ได้มาซึ่ง GMOs นั้นประกอบด้วย 3 ขั้นตอนหลัก ได้แก่ การสร้างดีเอ็นเอลูกผสม (Recombinant DNA) การนำเอาดีเอ็นเอลูกผสมเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน และสุดท้ายคือการคัดเลือก GMOs ที่มีคุณสมบัติที่ต้องการ

      ยีน gfp ที่บรรจุข้อมูลการสังเคราะห์โปรตีนเรืองแสง (Green Fluorescent Protein: GFP) จากแมงกะพรุน Aequorea victoria ในปัจจุบัน ได้ถูกดัดแปลง/ปรับปรุงให้สามารถแสดงออกได้ในสิ่งมีชีวิต หลายๆ ชนิด ได้แก่ แบคทีเรีย ยีสต์ เชื้อรา ปลา และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม รวมทั้งในเซลล์ของมนุษย์ นอกจากนี้ โปรตีนเรืองแสงเป็นโปรตีนที่มีขนาดเล็ก และสามารถตรวจสอบการทำงานได้โดยง่ายเพียงสังเกตการเรืองแสง โปรตีนเรืองแสงจึงมีประโยชน์อย่างมากในการช่วยให้นักวิจัยสามารถ ติดตามการทำงานของยีนที่สนใจได้อย่างเฉพาะเจาะจง ทั้งนี้ต้องอาศัยความช่วยเหลือจากการถ่ายภาพด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์ (Fluorescent Imaging System) หรือเครื่องวัดการวาวแสงสารละลายเคมี (Fluorescence Spectrophotometer) ตัวอย่างเช่น ในทางการแพทย์เมื่อต้องการศึกษาการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็ง การเชื่อมต่อยีน gfp กับยีนก่อมะเร็ง แล้วนำยีนเข้าสู่เซลล์หนูทดลอง Nude Mice จะทำให้เห็นถึงตำแหน่งของการเกิดมะเร็งตลอดจนการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็งเมื่อเวลาผ่านไปได้ หรือในทางเภสัชศาสตร์เมื่อต้องการทดสอบความสามารถของสารในการ ยับยั้งการเกิด Amyloid Plaques ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคสมองเสื่อม อัลไซเมอร์ นักวิจัยก็สามารถนำเอายีน gfp เชื่อมกับยีนที่สังเคราะห์โปรตีน Amyloid-ß (โปรตีนตั้งต้นที่จับตัวกันเป็น Amyloid Plaques) สังเคราะห์ ได้โปรตีนที่ใช้ทดสอบ AB-GFP โดยหลักการการทดสอบคือ โปรตีน AB-GFP เมื่ออยู่เป็นอิสระจะสามารถเรืองแสงได้ แต่เมื่อจับตัวกันจะสูญเสียความสามารถในการเรืองแสง ดังนั้น ถ้าหากมีสารที่นำมาทดสอบที่เมื่อผสมรวมกับ AB-GFP แล้วยังตรวจพบการเรืองแสงได้ แสดงว่าสารนั้น มีความเป็นไปได้ที่จะป้องกันโรคสมองเสื่อม อัลไซเมอร์ได้

     กิจกรรม “แบคทีเรียเรืองแสง” ได้ออกแบบให้สอดคล้องกับเนื้อหาชีววิทยาของนักเรียนชั้นมัธยมศึกษาตอนปลายที่เน้นวิทยาศาสตร์ ในหัวข้อที่เกี่ยวข้องกับพันธุวิศวกรรม โดยเฉพาะหัวข้อเทคโนโลยีทางดีเอ็นเอ ซึ่งกิจกรรมนี้จะเป็นประโยชน์กับนักเรียน ดังนี้

          (1) การเปิดโอกาสให้นักเรียนเรียนรู้เพิ่มเติมและทำความเข้าใจในศาสตร์นี้ผ่านการลงมือปฏิบัติจริง ภายใต้การดูแลของนักวิจัย/นักวิชาการ ที่มีประสบการณ์

          (2) การลงมือปฏิบัติจริง โดยนำยีนที่สร้างโปรตีนเรืองแสง gfpuv มาเป็นตัวอย่างให้นักเรียนโคลนเข้าสู่ดีเอ็นเอพาหะ แล้วนำเข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย Escherichia coli ทำให้ E.coli ที่รับเอาดีเอ็นเอของยีน gfpuv เข้าไป สามารถเรืองแสงได้เมื่อได้รับแสง UV เป็นการแสดงให้เห็นถึงขั้นตอนทางพันธุวิศวกรรมที่อาศัยเทคโนโลยีทางดีเอ็นเอมาสร้างสิ่งมีชีวิตที่ถูกดัดแปลง สารพันธุกรรม (Genetic Modified Organism: GMO) อย่างง่าย ที่สามารถทำได้ในเวลา 3 วัน และตรวจสอบคุณสมบัติที่เปลี่ยนแปลงไปได้เพียงสังเกต การเรืองแสงภายใต้ไฟฉาย UV

วัตถุประสงค์ของกิจกรรม

• เพื่อให้นักเรียนได้มีประสบการณ์การทำการทดลองที่เกี่ยวกับ เทคโนโลยีทางดีเอ็นเอผ่านการสร้างแบคทีเรียเรืองแสง
• เพื่อให้นักเรียนได้มีประสบการณ์การใช้และเข้าใจหลักการ การทำงานของเครื่องมือที่เกี่ยวข้องกับดีเอ็นเอ
• เพื่อให้นักเรียนเข้าใจหลักการและขั้นตอนทางพันธุวิศวกรรม ผ่านการสร้าง “แบคทีเรียเรืองแสง” ด้วยตัวเอง

เนื้อหาวิชาการ/ภาคปฏิบัติที่เกี่ยวข้อง

• การเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอโดยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่ (Polymerase Chain Reaction, PCR)
• การแยกดีเอ็นเอภายใต้กระแสไฟฟ้าผ่านเจลอะกาโรส (Agarose Gel Electrophoresis)
• การโคลนยีนโดยใช้พลาสมิดของแบคทีเรีย ซึ่งประกอบด้วยการเชื่อมต่อยีนเข้ากับพลาสมิด (Ligation) และการนำพลาสมิดลูกผสม (Recombinant Plasmid) เข้าสู่เซลล์แบคทีเรียเจ้าบ้านโดยอาศัยเทคนิคการกระตุ้นด้วยความร้อน (Heat-Shock Transformation)
• การตรวจสอบแบคทีเรียที่รับเอาพลาสมิดลูกผสมเข้าสู่เซลล์ด้วยเทคนิค Colony PCR
• การสกัดพลาสมิดจากเซลล์แบคทีเรียโดยใช้ชุดสกัดแบบคอลัมน์ (Plasmid Purification Kit)
• การตัดดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ (Restriction Enzyme)
• ประวัติความเป็นมาของการค้นพบโปรตีนเรืองแสง (GFP) จากแมงกะพรุนที่เริ่มต้นเมื่อปี ค.ศ. 1962 ซึ่งต่อเนื่องยาวนานและนำไปสู่รางวัลโนเบลในปี ค.ศ. 2008 ที่มอบให้กับนักวิทยาศาสตร์ที่เกี่ยวข้องถึง 3 คน

อุปกรณ์/เครื่องมือที่นักเรียนได้ใช้งานและเรียนรู้หลักการทำงานเบื้องต้น

• อุปกรณ์ดูด-จ่ายสารละลายปริมาตรน้อยแบบอัตโนมัติ (Autopipette)
• เครื่องเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอโดยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR Machine)
• ชุดอุปกรณ์แยกดีเอ็นเอด้วยกระแสไฟฟ้า (Gel Electrophoresis Apparatus)
• เครื่องปั่นเหวี่ยงความเร็วสูง (Centrifuge)
• เครื่องมองภาพเจลแบบใช้แสงแอลอีดีสีฟ้า (Blue Light LED Transilluminator)
• เตาไมโครเวฟ
• ไฟฉาย UV
• ตู้บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 37°C

     การจัดกิจกรรมในแต่ละครั้งสามารถรับนักเรียนเข้าร่วมกิจกรรมได้ครั้งละ 16 คน เนื่องจากข้อจำกัดด้านพื้นที่และอุปกรณ์ โดยในภาคปฏิบัติจะแบ่งนักเรียนออกเป็นกลุ่ม ๆ ละ 4 คน และได้รับการดูแลอย่างใกล้ชิดจากนักวิจัย/นักวิชาการที่มีประสบการณ์ โดยอุปกรณ์ในแต่ละกลุ่มมีดังนี้

     ชุด Autopipette ซึ่งประกอบด้วย Autopipette 4 ขนาด ได้แก่ ขนาด P1000, P200, P20 และ P2

     ชุดอุปกรณ์การเตรียมเจลอะกาโรส และชุดทำ Gel Electrophoresis

     ตะเกียงแอลกอฮอล์

สารเคมีที่ใช้

• ชุดสารสำหรับ PCR: ใช้ชุด 2X Mastermix ที่มีครบทั้งเอนไซม์ Taq Polymerase, dNTPs และบัฟเฟอร์ (Vivantis)
• ดีเอ็นเอต้นฉบับที่มียีน gfp (gfpuv: GenBank Accession no. AAB06048)
• ไพรเมอร์สาย Forward และ Reverse ที่จำเพาะต่อยีน gfpuv
• ดีเอ็นเอพาหะที่ใช้ คือ พลาสมิด 2/blunt (Thermo Fisher Scientific) ที่มาพร้อมกับเอนไซม์ ligase และบัฟเฟอร์
• ผงวุ้นอะกาโรส (Sigma-Aldrich)
• บัฟเฟอร์ TAE ความเข้มข้น 5X (Vivantis)
• สีย้อมดีเอ็นเอ nontoxic dye (Panreac AppliChem)
• ชุดสกัดพลาสมิดแบบใช้คอลัมน์ (Thermo Fisher Scientific)
• เอนไซม์ตัดจำเพาะ Bgl II แบบทำงานเร็ว (Thermo Fisher Scientific)
• อาหารเลี้ยงเชื้อ Luria-Bertani (LB) แบบวุ้นแข็ง และแบบเหลว (TM Media)
• ยาแอมพิซิลลิน (Panreac AppliChem)
• ดีเอ็นเอมาตรฐาน ชุด 1 kb-plus ladder (Thermo Fisher Scientific)
• สเปรย์แอลกอฮอล์ (เอทานอลความเข้มข้น 75 - 80%)

แบคทีเรียที่ใช้

      Escherichia coli JM109

     นักเรียนจะใช้เวลาในการทำกิจกรรมนี้ทั้งสิ้น 3 วัน โดยในแต่ละวัน จะเน้นการลงมือทำ แทรกการบรรยายเนื้อหาที่เกี่ยวข้องตามจังหวะของการรอผลการทดลอง

     กิจกรรมที่ลงมือปฏิบัติมีทั้งเป็นรายบุคคล รายกลุ่ม และผู้สอนจัดเตรียม ดังรายละเอียดในตาราง

ตารางกิจกรรมลงมือปฏิบัติ

     วิธีการทำการทดลองและเนื้อหาภาคทฤษฎีโดยสังเขป สามารถอ่านได้จากเอกสาร คู่มือกิจกรรมแบคทีเรียเรืองแสง ตาม URL: https://rb.gy/k8db6

     ภาพบางส่วนจากกิจกรรม “แบคทีเรียเรืองแสง” ที่จัดขึ้นที่ห้องปฏิบัติการ 3 – 4 บ้านวิทยาศาสตร์สิรินธร สวทช.

ผลการประเมินกิจกรรม “แบคทีเรียเรืองแสง” จากนักเรียนบางส่วนที่เข้าร่วมกิจกรรมนี้ ในปี พ.ศ. 2565 - 2566

• ลงมือปฏิบัติกิจกรรมจริง ๆ ทำให้พวกหนูได้ซึมซับเนื้อหาได้อย่างถ่องแท้ และมีความเข้าใจมากยิ่งขึ้น
• ได้ความรู้เรื่อง gfp เยอะมาก ๆ เลยค่ะ นอกจากจะได้ความรู้แล้ว ยังได้ฝึกทำแล็บ เพื่อเป็นแนวทางการตัดสินใจเลือกอาชีพในอนาคต นอกจากนั้น ได้รับมิตรภาพดี ๆ และความสนุกสนานมากมาย
• ได้มีความคุ้นชินกับห้องทดลองมากขึ้น ได้ทดลองและลงมือทำด้วยตนเอง ซึ่งตามปกตินั้นไม่ค่อยได้ทำการทดลองที่มีความซับซ้อนขนาดนั้น นอกจากนี้ ยังได้เรียนรู้วิธีการใช้อุปกรณ์ในห้องทดลองใหม่ ๆ ด้วย
• ได้รับประสบการณ์ในการใช้เครื่องมือวิทยาศาสตร์ต่าง ๆ จากผู้เชี่ยวชาญ และได้ทดลองการตัด DNA
• ได้ลงมือทำเยอะมาก ๆ ได้ลงมือปฏิบัติจริง ๆ และฟังบรรยาย ทำให้เรียนรู้ได้อย่างเข้าใจและจดจำได้ดี
• ได้ทดลองใช้เครื่องมือทางวิทยาศาสตร์ที่ยังไม่เคยใช้
• ได้ความรู้เพิ่มเติมทางวิทยาศาสตร์ด้วยว่า gfp คืออะไร มาจากไหน ใครทำ ใครคิด มีสีอะไร ใช้กับอะไร แล้วทำไมต้องมี ต้องหามาใช้ ทำไมต้องวิจัย
• ได้รู้ว่านักวิจัยทำงานกันแบบไหน ได้ลงมือทำจริง ๆ เกี่ยวกับ PCR
• ได้ความรู้เรื่องแบคทีเรียและกระบวนการ PCR
• ได้รับความรู้ใหม่ ๆ เยอะมากเลยค่ะ ทั้งทักษะการใช้เครื่องมือต่าง ๆ ในห้องแล็บ เช่น Autopipette การชั่งตวงวัดสารต่าง ๆ และได้ฝึกความละเอียดและความแม่นยำ
• ได้เรียนรู้เกี่ยวกับแบคทีเรียเรืองแสงและข้อมูลวิธีการในการตัดต่อ DNA สาเหตุต่าง ๆ ที่สามารถทำให้ผลคลาดเคลื่อน ประวัติความเป็นมาคร่าว ๆ ของการตัดต่อแบคทีเรียเรืองแสง ได้เรียนรู้วิธีการใช้อุปกรณ์ในห้องทดลอง

นำไปปรับใช้กับโครงงาน หรือการเลือกสายอาชีพในอนาคต ผลจากการประเมินความพึงพอใจของนักเรียนที่เข้าร่วมกิจกรรม “แบคทีเรียเรืองแสง” ในหัวข้อ ความรู้และประโยชน์ที่ได้รับ พบว่านักเรียนมากกว่า 90% (27 จาก 29 คน ที่ตอบแบบประเมินความพึงพอใจ) ให้คะแนนในระดับความพึงพอใจ มาก ถึง มากที่สุด

บทสรุป
     กิจกรรมแบคทีเรียเรืองแสงเป็นกิจกรรมที่รวบรวมเอาเทคนิคพื้นฐานทางด้านพันธุวิศวกรรมมาออกแบบเป็นหลักสูตรการเรียนรู้เพิ่มเติมระยะสั้นสำหรับนักเรียนชั้นมัธยมศึกษาตอนปลายที่เน้นวิทยาศาสตร์ โดยจะเน้นที่การลงมือปฏิบัติให้นักเรียนได้มีประสบการณ์การโคลนยีนและสามารถสร้างแบคทีเรียดัดแปลงพันธุกรรมที่ตรวจสอบได้ง่ายโดยสังเกตการเรืองแสง

บทความนี้เป็นส่วนหนึ่งของนิตยสาร สสวท. ปีที่ 51 ฉบับที่ 244 กันยายน – ตุลาคม 2566

ผู้อ่านสามารถติดตามบทความที่น่าสนใจเพิ่มเติมได้ที่ https://emagazine.ipst.ac.th/244/20/

บรรณานุกรม

Crameri A & Whitehorn EA & Tate E & Stemmer WP. (1996). Improved Green Fluorescent Protein by Molecular Evolution Using DNA Shuffling. Nat Biotechnol. 14(3): 315-9. doi: 10.1038/nbt0396-315. PMID: 9630892.

Kishimoto H, et al. (15 Aug 2011). Tumor-selective, adenoviral-mediated GFP genetic labeling of human cancer in the live mouse reports future recurrence after resection. Cell Cycle. 10(16):2737-41. doi: 10.4161/cc.10.16.16756. Epub 2011 Aug 15. PMID: 21785265; PMCID: PMC3219541.

Kim W, et al. (22 Aug 2006). A high-throughput screen for compounds that inhibit aggregation of the Alzheimer’s peptide. ACS Chem Biol. 1(7): 461-9. doi: 10.1021/cb600135w. PMID: 17168524.

สถาบันส่งเสริมการสอนวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (สสวท.) หนังสือเรียนรายวิชาเพิ่มเติมวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี ชีววิทยา ม.4 เล่ม 2. สืบค้นวันที่ 1 กรกฏาคม 2566, จาก https://proj14.ipst.ac.th/m4-6-biology/m4-bio-book2/.