การแยกเชื้อบริสุทธิ์
การแยกเชื้อบริสุทธิ์
การขีดเชื้อในจานเพาะเชื้อ (Streak plate) และการทำให้เชื้อกระจายในจานเพาะเชื้อ (Spread plate)
วิธี Streak-Plate Technique
การแยกเชื้อให้บริสุทธิ์เป็นเทคนิคพื้นฐานทางจุลชีววิทยาที่มีความสำคัญอย่างมาก เนื่องจากสิ่งแวดล้อมต่างๆ เช่น น้ำ อากาศ พื้นห้องเรียน หรือแม้แต่ร่างกายของคนก็มีเชื้อจุลินทรีย์อยู่หลายชนิดที่อาจปนเปื้อนในหลอดเพาะเชื้อได้ หลักการของการแยกเชื้อให้บริสุทธิ์บนอาหารเลี้ยงเชื้อ (Culture medium) คือ จะต้องแยกเชื้อให้ได้โคโลนีเดี่ยวๆ (Single colony) จำนวนมาก จากนั้นจึงนำเชื้อที่เป็นโคโลนีเดี่ยวไปศึกษารูปร่างลักษณะ และคุณสมบัติต่างๆ เพื่อให้ทราบว่าเป็นเชื้อชนิดใด เทคนิคที่นิยมใช้ในการแยกเชื้อบริสุทธิ์คือ วิธี cross streak plate ซึ่งทำได้โดยใช้ห่วงเขี่ยเชื้อ (Loop) แตะตัวอย่างหรือสิ่งส่งตรวจแล้วลากหรือขีด (Streak) ลงบนจานเพาะเชื้อที่มีอาหารแข็ง (Agar plate) อยู่ให้ได้แนวระนาบติดต่อกัน 4-5 เส้น หลังจากเสร็จในระนาบแรกซึ่งมีเชื้อจุลินทรีย์อยู่หนาแน่นที่สุด ให้นำห่วงเขี่ยเชื้อมาเผาไฟให้ลวดที่ปลายร้อนแดงเพื่อฆ่าเชื้อที่ติดให้หมด จากนั้นจึงขีดเชื้อจากส่วนของรอยลากในระนาบแรกออกมาเพียงหนึ่งครั้งแล้วลากเป็นระนาบที่สอง 4-5 เส้นติดกันโดยรอยขีดของเชื้อจะไม่ทับกับระนาบแรกอีก หลังจากนั้นก็ทำเช่นเดียวกันกับระนาบที่สองจนครบทั่วทั้งจานเพาะเชื้อซึ่งมีประมาณสี่ระนาบ เมื่อได้เชื้อบริสุทธิ์แล้วจะมีการศึกษาเชื้อต่อไปในด้านต่างๆ ซึ่งจะต้องมีการถ่ายเชื้อจากอาหารเดิมไปยังอาหารใหม่ หรือมีการเพาะเชื้อลงในอาหารเพื่อการทดสอบและการวิเคราะห์ต่างๆ ดังนั้นการเรียนรู้เทคนิคที่ถูกต้องในการถ่ายเชื้อจึงมีความสำคัญเป็นอย่างยิ่งซึ่งต้องอาศัยหลักการของ aseptic technique เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของเชื้อชนิดอื่นซึ่งจะทำให้ผลการทดลองผิดพลาดได้ อุปกรณ์พื้นฐานที่ใช้ในการถ่ายเชื้อคือ ห่วงเขี่ยเชื้อ เข็มเขี่ยเชื้อ (Needle) และตะเกียงแอลกอฮอล์สำหรับใช้ฆ่าเชื้อโดยการเผา (Incineration) การถ่ายเชื้อจุลินทรีย์พวกแบคทีเรียและยีสต์จะใช้ห่วงเขี่ยเชื้อเป็นส่วนใหญ่ มีบางครั้งที่ใช้เข็มเขี่ยเชื้อปลายตรง ส่วนเชื้อราที่เป็นเส้นสาย (filamentous fungi) มักจะใช้เข็มเขี่ยปลายงอ
วิธี Spread-Plate Technique
ในแหล่งธรรมชาตินั้นปกติเชื้อแบคทีเรียจะเติบโตอยู่รวมกันหลายๆสายพันธุ์ เพื่อการคัดแยกและจำแนกชนิดของแบคทีเรียแต่ละสายพันธุ์จะต้องมีขั้นตอนการทำให้เชื้อบริสุทธิ์ (Pure culture) โดยเทคนิคที่ทำได้ง่ายคือ spread plate technique ซึ่งเทคนิคนี้แบคทีเรียที่ถูกทำให้เจือจางให้มีจำนวนประมาณ 100-200 เซลล์ หรือน้อยกว่าจะถูกนำไปวางตำแหน่งตรงกลางของจานเพาะเชื้อ (Petri dish/plate) แล้วทำการเกลี่ยให้เชื้อกระจายทั่วด้วยแท่งแก้วรูปตัว L หลังจากบ่มที่อุณหภูมิที่เหมาะสมและมีระยะเวลาเพียงพอ จะปรากฏโคโลนี (Colony) ของเชื้อแบคทีเรียขึ้น โดยแต่ละโคโลนีจะมีจำนวนแบคทีเรียอยู่จำนวนมาก และแต่ละโคโลนีจะถือว่ามาจากแบคทีเรียสายพันธุ์เดียว ดังนั้นจะทำให้เกิดการแยกจุลินทรีย์ออกมาเป็นเชื้อบริสุทธิ์ขึ้น เมื่อมองด้วยตาเปล่าแบคทีเรียแต่ละสายพันธุ์โคโลนีจะมีลักษณะแตกต่างกัน
การเทเพลท (Pour – plate technique)
เทคนิคการเพาะเชื้อแบบ pour-plate technique ก็เป็นอีกวิธีการหนึ่งที่ใช้ในการแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ได้เช่นกัน โดยตัวอย่างเริ่มต้นจะถูกเจือจางให้มีความเข้มข้นหลายๆ ระดับด้วยเทคนิค serial dilution เพื่อทำให้เชื้อถูกเจือจางมากพอที่จะทำให้เกิดโคโลนีเดี่ยวๆ บนจานเพาะเชื้อ โดยนำตัวอย่างที่มีความเข้มข้นที่เหมาะสมเติมลงในจานเพาะเชื้อเปล่าที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว แล้วทำการเทอาหารวุ้นลง (Agar Medium) ไปในจานเพาะเชื้อ (โดยอุณหภูมิของอาหารเพาะเชื้อประมาณ 48-50 องศาเซลเซียส ซึ่งจะไม่ทำให้เชื้อแบคทีเรียและยีสต์ตายได้) ผสมอาหารและเชื้อให้เข้ากันและให้เกิดการกระจายอย่างสม่ำเสมอด้วยการหมุนจานเพาะเชื้อ เมื่อวุ้นเกิดการแข็งตัว เซลล์จุลินทรีย์จะถูกตรึงให้อยู่ด้านในของอาหาร และจะเกิดโคโลนีเดี่ยวๆ ของเชื้อขึ้นมา
การแยกเชื้อโดย pour-plate technique วิธีการแยกเชื้อให้บริสุทธิ์วิธีนี้ ทำได้ดังนี้
- นำหลอดอาหารที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อจำนวน 3 หลอด ไปหลอมให้ละลาย และแช่ใน Water bath ซึ่งมีอุณหภูมิประมาณ 45 องศาเซลเซียส
- นำลวดเขี่ยเชื้อ (Loop) ที่สะอาดปราศจากเชื้อจุ่มลงในหลอดที่มีเชื้อผสม แล้วนำไปใส่ในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อหลอดที่ 1 เขย่าหลอดเพื่อให้เชื้อกระจายทั่วหลอด
- นำ Loop ที่สะอาดปราศจากเชื้อจุ่มลงในเชื้อผสมหลอดที่ 1 ถ่ายลงในหลอดอาหารที่ 2 เขย่าเพื่อให้เชื้อแพร่กระจายทั่วหลอด
- นำ Loop ที่สะอาดปราศจากเชื้อจุ่มลงในเชื้อผสมหลอดที่ 2 ถ่ายลงในหลอดอาหารที่ 3 เขย่าเพื่อให้เชื้อแพร่กระจายทั่วหลอด
- นำอาหารในหลอดที่ 1 เทใส่จานเพาะเชื้อจานที่ 1 หมุนจานเบาๆ เพื่อให้เชื้อแบคทีเรียกระจายโดยทั่วจาน ปล่อยทิ้งไว้จนอาหารแข็งตัว
- นำอาหารในหลอดที่ 2 และ 3 เทใส่จานเพาะเชื้อจานที่ 2 และ 3 ตามลำดับ หมุนจานเบาๆ เพื่อให้เชื้อแบคทีเรียกระจายโดยทั่วจาน ปล่อยทิ้งไว้จนอาหารแข็งตัว
- นำจานเพาะเชื้อไปบ่มที่อุณหภูมิห้องหรืออุณหภูมิที่เหมาะสม ทิ้งไว้ประมาณ 24-48 ชม. จะเห็นโคโลนีเดี่ยวๆ ของแบคทีเรียเจริญขึ้นจนมีขนาดใหญ่พอที่จะเขี่ยเชื้อ หรือนำไปศึกษาคุณสมบัติอื่นๆ ต่อไป
ผลจากการแยกเชื้อบริสุทธิ์โดยวิธีนี้ จะพบว่าในจานเพาะเชื้อที่ 1 จะมีเชื้อเจริญหนาแน่นมากที่สุด สำหรับจานเพาะเชื้อที่ 2 และ 3 มีเชื้อเจริญหนาแน่นน้อยลงมาตามลำดับ นอกจากวิธีการแยกเชื้อบริสุทธิ์โดยวิธีนี้ ยังสามารถศึกษาการเจริญของแบคทีเรียในที่มีอากาศหรือไม่มีอากาศได้ด้วย ถ้าเชื้อมีการเจริญเฉพาะบนผิวหน้าอาหาร แสดงว่าเชื้อนั้นเจริญได้ดีในสภาพที่มีออกซิเจน ถ้าเชื้อใดเจริญบนก้นจานเพาะเชื้อ แสดงว่าเชื้อนั้นเจริญได้ดีในสภาพไม่มีออกซิเจน
Return to contents
การทำ ไร้เชื้อ (Sterilization)
การตายของจุลินทรีย์หมายถึงการสูญเสียความสามารถในการเพิ่มจำนวน ( Reproduce) อย่างถาวร การตายของจุลินทรีย์เป็นในรูป exponential นั่นคือจำนวนที่รอดชีวิตจะลดลงเป็นแบบอนุกรมเรขาคณิตเมื่อเทียบกับเวลา ทั้งนี้เนื่องจากว่าสมาชิกในประชากรมีสภาพไว (Sensivity) เหมือนกันคือ ตายง่ายๆ เท่า ๆ กัน การตายก่อนตายหลังของจุลินทรีย์แต่ละตัวขึ้นกับโอกาส (Probability) โดย slope ที่เป็น negative ของความสัมพันธ์ระหว่าง log N กับเวลา คืออัตราการตาย (Death rate) ซึ่ง death rate จะบอกเพียงสัดส่วนของประชากรที่รอดชีวิตในระยะเวลาที่กำหนดนั้นมีเท่าไหร่ถ้าต้องการรู้จำนวนรอดชีวิตที่แท้จริง เราต้องรู้ขนาดของประชากรเริ่มต้นดังนั้นในการกำ จัดเชื้อต้องคำนึงถึง death rate และขนาดของประชากรตั้งต้น (Initial population size)
การทำไร้เชื้ออาจทำได้หลายวิธี ได้แก่
- การทำไร้เชื้อโดยใช้ความร้อน (Sterilization by heat) เป็นวิธีที่ใช้กันมากที่สุด เนื่องจากว่าเป็นวิธีการฆ่าเชื้อที่ง่ายและเชื่อถือได้ โดยการใช้ความร้อนที่สูงพอ (มากกว่า 100 °C) และสภาวะที่เหมาะสมก็สามารถฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ได้ทุกชนิดแม้กระทั่งสปอร์ที่ทนทานต่อความร้อน ความร้อนสามารถนำ ไปประยุกต์ได้ 2 แบบคือ
1.1 ความร้อนแห้ง ความร้อนแห้งนั้นเชื่อกันว่าฆ่าเชื้อจุลินทรีย์โดยการทำให้เกิด destructive oxidation ขององค์ประกอบต่างๆ ที่สำคัญและจำ เป็นของเซลล์ การฆ่าสปอร์ที่มีความต้านทานมากที่สุดโดยความร้อนแห้งต้องใช้อุณหภูมิประมาณ 160° C เป็นเวลา 60 นาที ซึ่งอาจทำ ให้กระดาษ สำลีและสารอินทรีย์บางอย่างไหม้ (Charring)
1.2 ความร้อนชื้น ความร้อนชื้นจะฆ่าจุลินทรีย์โดยทำให้เกิด Coagulation และ Denaturing ของ enzymes และ structural protein ซึ่งเป็นกระบวนการที่ต้องอาศัยนํ้า การฆ่าสปอร์ที่ทนทานต่อความร้อนด้วยความร้อนชื้น จะต้องใช้ความร้อนชื้นที่ 121 °C เป็นเวลา 10-30 นาที ความร้อนชื้นมีประสิทธิภาพดีกว่าความร้อนแห้ง เพราะฆ่าเชื้อได้ที่อุณหภูมิตํ่ากว่าในระยะเวลาที่กำหนดหรือใช้เวลาน้อยกว่าที่อุณหภูมิที่เท่ากัน
ปัจจัยที่มีผลต่อการทำไร้เชื้อด้วยความร้อน
- อุณหภูมิและเวลา ที่ใช้ในการฆ่าเชื้อมีความสัมพันธ์แบบผกผัน (Inversely related) คือเวลาน้อยจะเพียงพอสำหรับฆ่าจุลินทรีย์ที่อุณหภูมิสูง เพราะฉะนั้นในการฆ่าชื้อนั้นจะต้องร้อนพอและนานพอ ในทางปฏิบัติแล้วการฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 °C เป็นเวลา 15 นาที โดยใช้ความร้อนชื้นพอเพียงที่จะฆ่าจุลินทรีย์ที่เป็น พวก Pathogenic spore-forming และพวก saprophyte ได้ทุกชนิด ยกเว้นพวกที่เป็น strict thermophile บางชนิดไม่สามารถเจริญที่อุณหภูมิน้อยกว่า 40 ° C
- จำนวนของจุลินทรีย์ และสปอร์
- ชนิด, สายพันธ์และความสามารถในการเกิดสปอร์ของจุลินทรีย์ก็มีส่วนต่อการรับไว้ได้ของจุลินทรีย์ต่อความร้อน vegetative form ของพวกแบคทีเรีย, ยีสต์และราส่วนใหญ่ และ animal virus ส่วนมากจะถูกฆ่าภายใน 10 นาที ที่อุณหภูมิระหว่าง 50 °C เช่น Neisseria gonorrhoea และ 65° C
- ธรรมชาติของสาร อาจมีผลต่ออัตราการฆ่า ถ้าหากมีสารที่เป็นองค์ประกอบของพวกสารอินทรีย์ เช่น พวกโปรตีน, gelatin,นํ้าตาล, แป้ง, กรดนิวคลีอิค, ไขมันและนํ้ามันที่มีปริมาณสูง มักจะมีแนวโน้มที่จะป้องกันสปอร์และ Vagetative cells จากการถูกฆ่าด้วยความร้อนโดยเฉพาะพวกไขมันและนํ้ามัน ผลของไขมันและนํ้ามันจะมีมากในความร้อนชื้นเพราะว่ามันเป็นตัวป้องกันไม่ให้ความชื้นเข้าไปในตัวของจุลินทรีย์
- ความเป็นกรด- เบส (pH) ก็เป็นสิ่งสำคัญ ความต้านทานต่อความร้อนและสปอร์จะสูงสุดใน pH ที่เป็นกลาง (pH 7) และจะลดลงที่ความเป็นกรด (Acidity) หรือความเป็นด่าง (Alkalinity) เพิ่มขึ้น เช่น สปอร์ของ Clostridium tetani ซึ่งถูกฆ่าด้วยความร้อนชื้น 100° C เป็นเวลา 29 นาที ที่ pH 7.2 จะถูกฆ่าภายใน 11 นาที หรือที่ pH 4.1 ปริมาณความร้อนที่ต้องการในการฆ่าจุลินทรีย์ชนิดใดชนิดหนึ่ง มักกล่าวในรูปของอุณหภูมิและเวลาที่เผย (Expose) ต่อความร้อน ซึ่งอาจเป็น Thermal death point คืออุณหภูมิตํ่าสุดที่ใช้ในการฆ่าเชื้ออย่างสมบูรณ์ใน aqueous solution ภายในเวลา 10 นาที หรือมักกล่าวในรูปของ Thermal death time คือระยะเวลาที่สั้นที่สุดสำหรับการฆ่าเชื้ออย่างสมบูรณ์ที่อุณหภูมิที่กำหนด
การทำไร้เชื้อด้วยความร้อนแห้ง มีหลายวิธี ได้แก่
- Red heat โดยการทำ ให้ร้อนด้วยเปลวไฟของตะเกียง bunsen จนร้อนแดง ใช้สำ หรับฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่ inoculating wires, loop, ปลาย forceps scaring, spatula
- Flaming ใช้สำ หรับ sterilize ปากขวดหรืออาหารเลี้ยงเชื้อ เข็ม มีดผ่าตัด กระจกสไลด์ coverslips โดยให้มันผ่านไปมาในเปลวไฟของตะเกียง bunsen โดยไม่ต้องทำ ให้ร้อนแดง พวกเข็มและมีดผ่าตัดมักจุ่มลงในแอลกอฮอล์ก่อนแล้วเผาให้ระเหยไป แต่วิธีนี้ไม่ได้ให้ความร้อนสูงพอสำหรับการทำ ไร้เชื้อ
- Hot air oven เป็นวิธีการทำ ไร้เชื้อด้วยความร้อนแห้งที่ใช้กันเป็นส่วนใหญ่ตู้อบถูกทำ ให้ร้อนด้วยไฟฟ้าและมีตัวควบคุมอุณหภูมิสำหรับรักษาระดับของอุณหภูมิให้คงที่ ควรมีพัดลมช่วยเป่าหรือช่วยในการหมุนเวียนของอากาศ และทำให้ load ได้รับความร้อนทั่วถึง มักใช้อุณหภูมิ 160-170 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง (ไม่นับ heating time) การใช้ Hot air oven เป็นวิธีที่ดีที่สุดในการฆ่าเชื้อพวกเครื่องแก้วที่แห้ง เช่น หลอดแก้ว, จานเลี้ยงเชื้อ และเครื่องมือต่างๆ เช่น มีดผ่าตัด, กรรไกร, เข็มฉีดยา และ Flask ก่อนฆ่าเชื้อควรอุดด้วยสำลี เครื่องแก้วอย่างอื่น เช่น ปิเปตอาจห่อด้วยกระดาษหรือใส่กระบอกโลหะ วิธีนี้ยังใช้ฆ่าเชื้อสารที่แห้งที่อยู่ในภาชนะที่ปิดมิดชิด พวก powder , ไขมัน, นํ้ามัน และไขซึ่งไม่ยอมให้ความชื้นผ่านไปได้ วัตถุเหล่านี้ความร้อนผ่านทะลุได้ช้ามาก จึงต้อง sterilize ทีละน้อย ๆ เป็นชั้นบาง ๆ เช่น ห่อไม่เกิน 10 กรัม หรือชั้นลึกไม่เกิน 5 มม. ในจานแก้ว สิ่งสำคัญที่ต้องควรจำ ก็คือของทุกอย่างที่นำเข้า hot air oven นี้ต้องแห้งมิฉะนั้นจะแตก
- การทำ ไร้เชื้อด้วยรังสี (Sterilization by radiation) อาจใช้ UV หรือ ionizing radiation ก็ได้โดยที่ UV radiation มีอำนาจทะลุทะลวงตํ่า จึงใช้ฆ่าเชื้อเฉพาะที่ผิวหนังเท่านั้น และต้องส่องวัตถุที่ต้องการฆ่าเชื้อโดยตรง และต้องมีความเข้มและระยะเวลาในการถูกแสงนานพอการฉายรังสี UV จะเหนี่ยวนำ ทำให้เกิดthymine dimmers ใน DNA ซึ่งจะขัดขวางการจำ ลองตัว (Replication)
- การทำ ไร้เชื้อโดยการกรอง (Sterilization by Filtration) การทำไร้เชื้อโดยการกรองเป็นการนำจุลินทรีย์ออกจากของเหลวที่ไม่คงตัวต่อความร้อน วิธีนี้มีประโยชน์โดยเฉพาะอย่างยิ่งใช้ในการเตรียม Soluble product ของแบคทีเรีย สารปฏิชีวนะ ทำได้โดยการให้ของเหลวผ่านเครื่องกรอง (Filter) ที่มีขนาดของรูพรุนน้อยกว่า 0.5 um แต่พวกไวรัสและ mycoplasma มักผ่านได้
- การทำไร้เชื้อโดยใช้สารเคมี (Chemical sterilization) มีสารเคมีหลายชนิดที่มีคุณสมบัติในการฆ่าเชื้อโรคได้ สารพวกนี้เรียกว่าสารทำลายเชื้อ (Disinfectant) บางชนิดเรียกว่าสารระงับเชื้อ (Antiseptics) ตัวอย่างสารเคมีที่นิยมใช้คือ Alcohols เช่น Ethanol 70% ฆ่าเชื้อโรคได้ดีเป็นส่วนมาก แต่เชื้อบางอย่างต้องใช้ความเข้มข้นที่สูงกว่านี้ Methanol ให้ผลน้อยกว่า Ethanol นอกจากนี้ยังเป็นพิษ Alcohol อย่างอื่น เช่น Propyl, Butyl, Amyl ฆ่าเชื้อได้ดีกว่า Ethanol
Return to contents
ม.5
ม.6
นักเรียน
