การแยกเชื้อบริสุทธิ์
การขีดเชื้อในจานเพาะเชื้อ (Streak plate) และการทำให้เชื้อกระจายในจานเพาะเชื้อ (Spread plate)
วิธี Streak-Plate Technique
การแยกเชื้อให้บริสุทธิ์เป็นเทคนิคพื้นฐานทางจุลชีววิทยาที่มีความสำคัญอย่างมาก เนื่องจากสิ่งแวดล้อมต่างๆ เช่น น้ำ อากาศ พื้นห้องเรียน หรือแม้แต่ร่างกายของคนก็มีเชื้อจุลินทรีย์อยู่หลายชนิดที่อาจปนเปื้อนในหลอดเพาะเชื้อได้ หลักการของการแยกเชื้อให้บริสุทธิ์บนอาหารเลี้ยงเชื้อ (Culture medium) คือ จะต้องแยกเชื้อให้ได้โคโลนีเดี่ยวๆ (Single colony) จำนวนมาก จากนั้นจึงนำเชื้อที่เป็นโคโลนีเดี่ยวไปศึกษารูปร่างลักษณะ และคุณสมบัติต่างๆ เพื่อให้ทราบว่าเป็นเชื้อชนิดใด เทคนิคที่นิยมใช้ในการแยกเชื้อบริสุทธิ์คือ วิธี cross streak plate ซึ่งทำได้โดยใช้ห่วงเขี่ยเชื้อ (Loop) แตะตัวอย่างหรือสิ่งส่งตรวจแล้วลากหรือขีด (Streak) ลงบนจานเพาะเชื้อที่มีอาหารแข็ง (Agar plate) อยู่ให้ได้แนวระนาบติดต่อกัน 4-5 เส้น หลังจากเสร็จในระนาบแรกซึ่งมีเชื้อจุลินทรีย์อยู่หนาแน่นที่สุด ให้นำห่วงเขี่ยเชื้อมาเผาไฟให้ลวดที่ปลายร้อนแดงเพื่อฆ่าเชื้อที่ติดให้หมด จากนั้นจึงขีดเชื้อจากส่วนของรอยลากในระนาบแรกออกมาเพียงหนึ่งครั้งแล้วลากเป็นระนาบที่สอง 4-5 เส้นติดกันโดยรอยขีดของเชื้อจะไม่ทับกับระนาบแรกอีก หลังจากนั้นก็ทำเช่นเดียวกันกับระนาบที่สองจนครบทั่วทั้งจานเพาะเชื้อซึ่งมีประมาณสี่ระนาบ เมื่อได้เชื้อบริสุทธิ์แล้วจะมีการศึกษาเชื้อต่อไปในด้านต่างๆ ซึ่งจะต้องมีการถ่ายเชื้อจากอาหารเดิมไปยังอาหารใหม่ หรือมีการเพาะเชื้อลงในอาหารเพื่อการทดสอบและการวิเคราะห์ต่างๆ ดังนั้นการเรียนรู้เทคนิคที่ถูกต้องในการถ่ายเชื้อจึงมีความสำคัญเป็นอย่างยิ่งซึ่งต้องอาศัยหลักการของ aseptic technique เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของเชื้อชนิดอื่นซึ่งจะทำให้ผลการทดลองผิดพลาดได้ อุปกรณ์พื้นฐานที่ใช้ในการถ่ายเชื้อคือ ห่วงเขี่ยเชื้อ เข็มเขี่ยเชื้อ (Needle) และตะเกียงแอลกอฮอล์สำหรับใช้ฆ่าเชื้อโดยการเผา (Incineration) การถ่ายเชื้อจุลินทรีย์พวกแบคทีเรียและยีสต์จะใช้ห่วงเขี่ยเชื้อเป็นส่วนใหญ่ มีบางครั้งที่ใช้เข็มเขี่ยเชื้อปลายตรง ส่วนเชื้อราที่เป็นเส้นสาย (filamentous fungi) มักจะใช้เข็มเขี่ยปลายงอ
วิธี Spread-Plate Technique
ในแหล่งธรรมชาตินั้นปกติเชื้อแบคทีเรียจะเติบโตอยู่รวมกันหลายๆสายพันธุ์ เพื่อการคัดแยกและจำแนกชนิดของแบคทีเรียแต่ละสายพันธุ์จะต้องมีขั้นตอนการทำให้เชื้อบริสุทธิ์ (Pure culture) โดยเทคนิคที่ทำได้ง่ายคือ spread plate technique ซึ่งเทคนิคนี้แบคทีเรียที่ถูกทำให้เจือจางให้มีจำนวนประมาณ 100-200 เซลล์ หรือน้อยกว่าจะถูกนำไปวางตำแหน่งตรงกลางของจานเพาะเชื้อ (Petri dish/plate) แล้วทำการเกลี่ยให้เชื้อกระจายทั่วด้วยแท่งแก้วรูปตัว L หลังจากบ่มที่อุณหภูมิที่เหมาะสมและมีระยะเวลาเพียงพอ จะปรากฏโคโลนี (Colony) ของเชื้อแบคทีเรียขึ้น โดยแต่ละโคโลนีจะมีจำนวนแบคทีเรียอยู่จำนวนมาก และแต่ละโคโลนีจะถือว่ามาจากแบคทีเรียสายพันธุ์เดียว ดังนั้นจะทำให้เกิดการแยกจุลินทรีย์ออกมาเป็นเชื้อบริสุทธิ์ขึ้น เมื่อมองด้วยตาเปล่าแบคทีเรียแต่ละสายพันธุ์โคโลนีจะมีลักษณะแตกต่างกัน
การเทเพลท (Pour – plate technique)
เทคนิคการเพาะเชื้อแบบ pour-plate technique ก็เป็นอีกวิธีการหนึ่งที่ใช้ในการแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ได้เช่นกัน โดยตัวอย่างเริ่มต้นจะถูกเจือจางให้มีความเข้มข้นหลายๆ ระดับด้วยเทคนิค serial dilution เพื่อทำให้เชื้อถูกเจือจางมากพอที่จะทำให้เกิดโคโลนีเดี่ยวๆ บนจานเพาะเชื้อ โดยนำตัวอย่างที่มีความเข้มข้นที่เหมาะสมเติมลงในจานเพาะเชื้อเปล่าที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว แล้วทำการเทอาหารวุ้นลง (Agar Medium) ไปในจานเพาะเชื้อ (โดยอุณหภูมิของอาหารเพาะเชื้อประมาณ 48-50 องศาเซลเซียส ซึ่งจะไม่ทำให้เชื้อแบคทีเรียและยีสต์ตายได้) ผสมอาหารและเชื้อให้เข้ากันและให้เกิดการกระจายอย่างสม่ำเสมอด้วยการหมุนจานเพาะเชื้อ เมื่อวุ้นเกิดการแข็งตัว เซลล์จุลินทรีย์จะถูกตรึงให้อยู่ด้านในของอาหาร และจะเกิดโคโลนีเดี่ยวๆ ของเชื้อขึ้นมา
การแยกเชื้อโดย pour-plate technique วิธีการแยกเชื้อให้บริสุทธิ์วิธีนี้ ทำได้ดังนี้
ผลจากการแยกเชื้อบริสุทธิ์โดยวิธีนี้ จะพบว่าในจานเพาะเชื้อที่ 1 จะมีเชื้อเจริญหนาแน่นมากที่สุด สำหรับจานเพาะเชื้อที่ 2 และ 3 มีเชื้อเจริญหนาแน่นน้อยลงมาตามลำดับ นอกจากวิธีการแยกเชื้อบริสุทธิ์โดยวิธีนี้ ยังสามารถศึกษาการเจริญของแบคทีเรียในที่มีอากาศหรือไม่มีอากาศได้ด้วย ถ้าเชื้อมีการเจริญเฉพาะบนผิวหน้าอาหาร แสดงว่าเชื้อนั้นเจริญได้ดีในสภาพที่มีออกซิเจน ถ้าเชื้อใดเจริญบนก้นจานเพาะเชื้อ แสดงว่าเชื้อนั้นเจริญได้ดีในสภาพไม่มีออกซิเจน
การทำ ไร้เชื้อ (Sterilization)
การตายของจุลินทรีย์หมายถึงการสูญเสียความสามารถในการเพิ่มจำนวน ( Reproduce) อย่างถาวร การตายของจุลินทรีย์เป็นในรูป exponential นั่นคือจำนวนที่รอดชีวิตจะลดลงเป็นแบบอนุกรมเรขาคณิตเมื่อเทียบกับเวลา ทั้งนี้เนื่องจากว่าสมาชิกในประชากรมีสภาพไว (Sensivity) เหมือนกันคือ ตายง่ายๆ เท่า ๆ กัน การตายก่อนตายหลังของจุลินทรีย์แต่ละตัวขึ้นกับโอกาส (Probability) โดย slope ที่เป็น negative ของความสัมพันธ์ระหว่าง log N กับเวลา คืออัตราการตาย (Death rate) ซึ่ง death rate จะบอกเพียงสัดส่วนของประชากรที่รอดชีวิตในระยะเวลาที่กำหนดนั้นมีเท่าไหร่ถ้าต้องการรู้จำนวนรอดชีวิตที่แท้จริง เราต้องรู้ขนาดของประชากรเริ่มต้นดังนั้นในการกำ จัดเชื้อต้องคำนึงถึง death rate และขนาดของประชากรตั้งต้น (Initial population size)
การทำไร้เชื้ออาจทำได้หลายวิธี ได้แก่
1.1 ความร้อนแห้ง ความร้อนแห้งนั้นเชื่อกันว่าฆ่าเชื้อจุลินทรีย์โดยการทำให้เกิด destructive oxidation ขององค์ประกอบต่างๆ ที่สำคัญและจำ เป็นของเซลล์ การฆ่าสปอร์ที่มีความต้านทานมากที่สุดโดยความร้อนแห้งต้องใช้อุณหภูมิประมาณ 160° C เป็นเวลา 60 นาที ซึ่งอาจทำ ให้กระดาษ สำลีและสารอินทรีย์บางอย่างไหม้ (Charring)
1.2 ความร้อนชื้น ความร้อนชื้นจะฆ่าจุลินทรีย์โดยทำให้เกิด Coagulation และ Denaturing ของ enzymes และ structural protein ซึ่งเป็นกระบวนการที่ต้องอาศัยนํ้า การฆ่าสปอร์ที่ทนทานต่อความร้อนด้วยความร้อนชื้น จะต้องใช้ความร้อนชื้นที่ 121 °C เป็นเวลา 10-30 นาที ความร้อนชื้นมีประสิทธิภาพดีกว่าความร้อนแห้ง เพราะฆ่าเชื้อได้ที่อุณหภูมิตํ่ากว่าในระยะเวลาที่กำหนดหรือใช้เวลาน้อยกว่าที่อุณหภูมิที่เท่ากัน
ปัจจัยที่มีผลต่อการทำไร้เชื้อด้วยความร้อน
การทำไร้เชื้อด้วยความร้อนแห้ง มีหลายวิธี ได้แก่
สถาบันส่งเสริมการสอนวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (สสวท.) กระทรวงศึกษาธิการ เป็นหน่วยงานของรัฐที่ไม่แสวงหากำไร ได้จัดทำเว็บไซต์คลังความรู้ SciMath เพื่อส่งเสริมการสอนวิทยาศาสตร์ คณิตศาสตร์และเทคโนโลยีทุกระดับการศึกษา โดยเน้นการศึกษาขั้นพื้นฐานเป็นหลัก หากท่านพบว่ามีข้อมูลหรือเนื้อหาใด ๆ ที่ละเมิดทรัพย์สินทางปัญญาปรากฏอยู่ในเว็บไซต์ โปรดแจ้งให้ทราบเพื่อดำเนินการแก้ปัญหาดังกล่าวโดยเร็วที่สุด
The Institute for the Promotion of Teaching Science and Technology (IPST), Ministry of Education, a non-profit organization under the Thai government, developed SciMath as a website that provides educational resources in Science, Mathematics and Technology. IPST invites visitors to use its online resources for personal, educational and other non-commercial purpose. If there are any problems, please contact us immediately.
Copyright © 2018 SCIMATH :: คลังความรู้ SciMath. Terms and Conditions. Privacy. , All Rights Reserved.
อีเมล: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it. (ให้บริการในวันและเวลาราชการเท่านั้น)